ชีวสังเคราะห์ของเทอร์ปีนอยด์อินโดลแอลคาลอยด์: โคลน ศึกษาคุณลักษณะและการแสดงออกของยีน dxs และ dxr จากกระท่อม

Titleชีวสังเคราะห์ของเทอร์ปีนอยด์อินโดลแอลคาลอยด์: โคลน ศึกษาคุณลักษณะและการแสดงออกของยีน dxs และ dxr จากกระท่อม
Publication TypeReport
Year of Publication2010
Authorsหวังสินทวีกุล, จุไรทิพย์
Series Title-
Date Published2010
Institutionมหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์
Typeโครงการวิจัย
Report NumberRMU4980023
ISBN NumberRMU4980023
KeywordscDNA cloning, expression, mitragyna speciosa, Mitragynine, terpenoid indole alkaloid biosynthesis
Abstract

การศึกษาครั้งนี้ได้โคลน cDNA ของยีน 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (msdxs) และ 1-deoxy-Dxylulose 5-phosphate reductoisomerase (msdxr) จากส่วนใบกระท่อม โดยเทคนิค homology-based polymerase chain reaction (PCR) และ rapid amplification of cDNA ends (RACE) ผลการศึกษาคุณลักษณะของ cDNA ของยีน msdxs พบว่ายีน msdxs ในกระท่อมปรากฎอย่างน้อย 2 รูปแบบ เรียกว่า msdxs1 และ msdxs2 คุณลักษณะของ msdxs1 cDNA ประกอบด้วย open reading frame (ORF) ขนาด 2,010 คู่เบส เมื่อถอดรหัสเป็นสายกรดอะมิโน ได้ ลำดับกรดอะมิโนจำนวน 669 หน่วยอะมิโน มวลโมเลกุลมีค่า 71.9 กิโลดาลตัน และมีค่า pI เท่ากับ 6.89 ส่วนคุณลักษณะของ msdxs2 ประกอบด้วย ORF ขนาด 2,193 คู่เบส ถอดรหัสเป็นกรดอะมิโนจำนวน 730 หน่วยอะมิโนมวลโมเลกุลมีค่า 78.6 กิโลดาลตัน และมีค่า pI เท่ากับ 6.46 เมื่อเปรียบเทียบสายกรดอะมิโนระหว่าง MSDXS1 และ MSDXS2 พบว่ามีค่าความเหมือน 66% เมื่อวิเคราะห์ลำดับสายกรดอะมิโน พบว่า MSDXS1 และ MSDXS2 ประกอบด้วยส่วนของ thiamine diphosphate-binding motif และ transketolase motif ซึ่งเป็นลักษณะของโปรตีนกลุ่ม transketolase สำหรับการโคลนยีน msdxr คุณลักษณะของ cDNA ที่ได้ประกอบด้วย ORF ขนาด 1,317 คู่เบสถอดรหัสเป็นกรดอะมิโนจำนวน 438 หน่วยอะมิโน คำมวลโมเลกุลมีค่า 47.5 กิโลดาลตัน และมีค่า pI เท่ากับ 6.43 เมื่อวิเคราะห์สายกรดอะมิโนของ MSDXR พบว่าประกอบด้วยส่วน chloroplast transit peptide ที่ทำหน้านำส่งโปรตีนเข้าสู่พลาสติด บริเวณของ proline rich ตำแหน่งของ NADPH binding motif และหน่วยอะมิโนที่มีส่วนสำคัญต่อการเร่งปฏิกิริยา เมื่อวิเคราะห์ความเหมือนของสายกรดอะมิโนของ MSDXR กับ DXR ในพืชอื่นๆ พบว่ามีค่าความเหมือนมากกว่า 80% เมื่อศึกษาบทบาทหน้าที่ในระดับเซลล์ของ MSDXS1 และ MSDXS2 ในต้นกระท่อม โดยใช้ต้นกระท่อมที่ผ่านกระบวนการ regenerated จากการเหนี่ยวนำรากลอยด้วย Agrobacterium rhizogenes เป็นพืชต้นแบบ ทั้งนี้เนื่องจากต้น regenerated มีปริมาณ mitragynine สะสมในปริมาณสูง เมื่อวัดระดับการแสดงออกของ mRNA ของยีน msdxs1 และ msdxs2 โดยวิธี quantitative real-time (qRT) PCR ของต้น regenerated เปรียบเทียบกับต้นในสภาวะทดลอง (เพาะได้จากเมล็ด) ผลการทดลองพบว่า mRNA ของ msdxs1 ของต้น regenerated ส่วนของใบ ลำต้น และราก มีระดับการแสดงออกของยีนสูงกว่าต้นที่เพาะจากเมล็ด 1.5 เท่า ในขณะที่ระดับการแสดงออกของ msdxs2 ในส่วนของใบและลำต้นของต้น regenerated มีค่าน้อยกว่าต้นเพาะจากเมล็ด ถึง 50% เนื่องจาก mitragynine มีแหล่งสะสมส่วนใหญ่อยู่ที่ใบ จากผลการทดลองนี้สรุปได้ว่า MSDXS1 มีส่วนสำคัญต่อชีวสังเคราะห์ mitragynine มากกว่า MSDXS2 การศึกษาครั้งนี้ยังได้เหนี่ยวนำการแสดงออกของยีน msdxr ในรูป pseudomature form (ตัดส่วน plastidtargeting sequence) ในเชื้อ E.coli ภายหลังจากเหนี่ยวนำด้วย IPTG พบว่าเซลล์ E. coli สามารถสร้าง MSDXR ในรูป soluble form โดยปรากฎมวลโมเลกุลประมาณ 42 กิโลดาลตัน บนแผ่น SDS-PAGE และ MSDXR ส่วนใหญ่อยู่ในรูป insoluble form

URLhttp://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RMU4980023
Alternate TitleBiosynthesis of terpenoid indole alkaloid: Molecular cloning, characterization and expression of dxs and dxr genes from Mitragyna speciosa Korth.