การผลิตแอสตาแซนทินต้นทุนต่ำและการพัฒนาการนำส่งสารสู่เซลล์

Titleการผลิตแอสตาแซนทินต้นทุนต่ำและการพัฒนาการนำส่งสารสู่เซลล์
Publication TypeReport
Year of Publication2012
Authorsจิรศรีพงศ์พันธ์, กัลยาณี
Series Editorจิระกาญจนากิจ, นวลอนงค์, วัฒนการุณ วนิดา
Series Title-
Date Published2012
Institutionมหาวิทยาลัยศิลปากร
Typeโครงการวิจัย
Report NumberDBG5180019
ISBN NumberDBG5180019
Keywordsanticancer, antioxidant, astaxantin, bioavailability, delivery, P. rhodozyma, การต้านอนุมูลอิสระ, การนำส่ง, การยับยั้งเซลล์มะเร็ง, ชีวปริมาณออกฤทธิ์, ฟาเฟีย โรโดซัยมา, แอสตาแซนทิน
Abstract

แอสตาแซนทิน สารแคโรทีนอยด์สีแดงที่นิยมใช้เป็นอาหารเสริมให้สัตว์มีสีสันสวยงามตามความต้องการของผู้บริโภค เป็นสารที่มีคุณสมบัติต้านการเกิดออกซิเดชันที่ดีกว่าแคโรทีนอยด์ชนิดอื่นๆ จึงมีการนำมาพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์อาหารเสริมที่เป็นประโยชน์ต่อสุขภาพในการป้องกันการเกิดโรคต่างๆ อย่างไรก็ตามปริมาณการผลิตแอสตาแซนทินที่มีน้อยในยีสต์ ทำให้แอสตาแซนทินมีราคาแพงไม่คุ้มทุนต่อการทำเป็นผลิตภัณฑ์ รวมทั้งปัญหาจากคุณสมบัติการชอบไขมัน (lipophilic) ทำให้แอสตาแซนทินไม่สามารถเข้าสู่เซลล์และเกิดประสิทธิผลที่ดีได้ โครงการวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์ที่จะลดต้นทุนการผลิตของแอสตาแซนทิน โดยการกลายพันธุ์ยีสต์และการใช้วัสดุทางการเกษตรเป็นวัตถุดิบในการเลี้ยงยีสต์ ศึกษาคุณสมบัติต่างๆของแอสตาแซนทินที่ผลิตได้จากยีสต์ รวมทั้งปรับปรุงการนำส่งสารแอสตาแซนทินสู่เซลล์ และทดสอบประยุกต์ใช้ผลิตภัณฑ์แอสตาแซนทินที่ได้

การกลายพันธุ์ยีสต์ Phaffia rhodozyma ด้วย Ethyl methanesulphonate (EMS) เพื่อให้ได้สายพันธุ์กลายพันธุ์ที่ผลิตแคโรทีนอยด์ได้มากขึ้น พบว่าเมื่อเพิ่มความเข้มข้น EMS มากขึ้น จะมีผลให้อัตราการรอดของเซลล์ลดลงและให้ผลการกลายพันธุ์แตกต่างกันขึ้นกับสายพันธุ์ดั้งเดิมของยีสต์ โดยสายพันธุ์ GM807 และ N78 สามารถกลายพันธุ์ซ้ำและให้โคโลนียีสต์เป็นสีส้มแดง ขณะที่สายพันธุ์ FN99 ให้โคโลนีทั้งสีส้ม เหลืองและขาว และเฉพาะสายพันธุ์ GM807 เท่านั้นที่สามารถกลายพันธุ์ให้ยีสต์ที่ผลิตแคโรทีนอยด์ได้สูงกว่าสายพันธุ์ดั้งเดิม 2.7 เท่า แต่เมื่อมีการถ่ายเลี้ยงพบว่าการผลิตแคโรทีนอยด์ของยีสต์กลายพันธุ์ไม่คงที่ จึงทำการกลายพันธุ์ซ้ำๆ ต่อไปร่วมกับการคัดเลือกโคโลนีบนอาหารที่มี β-ionone พบว่ายีสต์ที่คัดเลือกได้สามารถผลิตแคโรทีนอยด์ได้สูงและค่อนข้างคงที่มากขึ้นกว่าสายพันธุ์ดั้งเดิม และเมื่อวิเคราะห์ปริมาณแอสตาแซนทินจากยีสต์ด้วย HPLC พบว่าการกลายพันธุ์ด้วย EMS สามารถทำให้ยีสต์กลายพันธุ์มีสัดส่วนการผลิตปริมาณแอสตาแซนทินเพิ่มขึ้นจากเดิม

การศึกษาการเจริญและการผลิตแคโรทีนอยด์จากยีสต์กลายพันธุ์ที่คัดเลือกคือ GBF8, GBF9 และ S4 ในอาหาร YM เทียบกับ GM807 พบว่า ยีสต์ทั้งสี่สายพันธุ์สามารถเจริญในรูปแบบเดียวกันโดยให้มวลเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วภายในวันที่ 2 และหลังจากนั้นก็จะคงที่ ขณะที่การผลิตแคโรทีนอยด์จะค่อยๆ เพิ่มขึ้นและมีปริมาณสูงสุดในวันที่ 6 โดย GBF9 เป็นสายพันธุ์ให้ปริมาณแคโรทีนอยด์สูงที่สุด ยีสต์ทั้งสี่สายพันธุ์เจริญได้ดีที่ pH 6.5 แต่ผลิตแคโรทีนอยด์ได้ดีที่ pH ต่ำกว่า การศึกษาอาหารเลี้ยงยีสต์จากผลิตผลทางการเกษตรได้แก่ น้ำสับปะรด น้ำมะพร้าว น้ำฝรั่งและน้ำอ้อย พบว่ายีสต์ทั้งสี่สายพันธุ์สามารถเจริญและให้ปริมาณแคโรทีนอยด์เมื่อเลี้ยงในน้ำสับปะรดได้ดีที่สุด และมากกว่าน้ำมะพร้าว น้ำอ้อยตามลำดับ GBF9 ยังสามารถใช้แหล่งไนโตรเจนราคาถูกของยูเรียได้ดี การปรับสัดส่วนของ C:N ในอาหารเลี้ยงที่เหมาะสมจะทำให้ยีสต์ผลิตแคโรทีนอยด์ได้เพิ่มขึ้น

การศึกษาคุณสมบัติของแอสตาแซนทินที่สกัดได้จากยีสต์กลายพันธุ์ในเซลล์เพาะเลี้ยง เปรียบเทียบกับแอสตาแซนทินบริสุทธิ์หรือ β-carotene พบว่าตัวทำละลายที่เหมาะสมสำหรับแอสตาแซนทินและ β-carotene คือ สารละลาย DMSO และ THF ซึ่งสามารถใช้ได้ที่ความเข้มข้นไม่เกิน 1% สารสกัดแอสตาแซนทินจากยีสต์ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ Hela, HepG2 และ Vero อีกทั้งไม่มีฤทธิ์ในการทำลายเซลล์มะเร็ง เนื่องจากให้อัตราการเจริญของเซลล์เพิ่มขึ้นโดยให้ผลดีที่สุดในเซลล์ Vero HepG2 และ Hela ตามลำดับ อย่างไรก็ตาม แอสตาแซนทินมีผลต้านออกซิเดชันที่เกิดจาก tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) ได้ดี โดย astaxanthin และ β-carotene จะช่วยให้ความมีชีวิตของเซลล์เพิ่มขึ้น โดยให้ผลการป้องกันเซลล์ Vero ได้ดีกว่าเซลล์ Hela และการตรวจวัดความสามารถต้าน lipid peroxidation ของแอสตาแซนทินในเซลล์ Vero โดยวัดระดับของ malondialdehyde (MDA) พบว่าแอสตาแซนทินสามารถบรรเทาภาวะเครียดออกซิเดชันที่เกิดขึ้นจาก t-BHP ได้ดี ส่วนการศึกษาคุณสมบัติของแอสตาแซนทินในสภาวะที่ไม่มีเซลล์ โดยวัดความสามารถต้านอนุมูลอิสระด้วย DPPH assay ใน microplate system พบว่า DMSO เป็นตัวทำละลายที่เหมาะสมที่สุดซึ่งจะไม่มีผลต่อการสลายตัวของสารละลายอนุมูล DPPH การศึกษาหาค่า Effective dose concentration 50% (EC50) พบว่า astaxanthin สังเคระห์มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระมากกว่า β-carotene และ α-tocopherol เป็น 2.85 และ 4.43 เท่าตามลำดับ อย่างไรก็ตามสารสกัดจากยีสต์มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระต่ำกว่าเนื่องจากการปนเปื้อนของตัวทำละลายในการสกัด และปริมาณแอสตาแซนทินที่มีอยู่เพียง 74% เมื่อเทียบกับแอสตาแซนทินสังเคราะห์ที่เป็นสารบริสุทธิ์ ซึ่งมีผลให้ความสามารถต้านอนุมูลอิสระของแอสตาแซนทินสกัดจากยีสต์ลดลงได้

การพัฒนาระบบการนำส่งแอสตาแซนทินเข้าสู่เซลล์เพื่อลดข้อจำกัดของแอสตาแซนทิน จากคุณสมบัติความชอบไขมัน ละลายน้ำได้น้อย และความไม่เสถียร ทำโดยการใช้สารในกลุ่มพอลิเมอร์ ชนิด lipid-based (ได้แก่ methyl- β –cyclodextrin (Mβ-CD) และ liposome) และสารลดแรงตึงผิว (ได้แก่ tween 80 และ glycerol) และทดสอบกับเซลล์ HepG2 พบว่า tween 80, Mβ-CD และ glycerol สามารถใช้เป็นพาหนะนำส่งในระดับความเข้มข้นที่น้อยกว่า 0.1% (v/v), 0.2% (w/v) และ 2% (v/v) ตามลำดับได้ โดย liposome มีประสิทธิภาพสูงสุดในการนำส่งแอสตาแซนทินเข้าสู่เซลล์ภายในเวลา 24 ชั่วโมง นอกจากนี้พาหะนำส่งยังช่วยรักษาความเสถียรของแอสตาแซนทินได้ดีในสภาวะการบ่มที่อุณหภูมิห้อง แต่ไม่มีผลช่วยรักษาความเสถียรของแอสตาแซนทินได้เมื่อบ่มที่ 4 °C ในที่มืด การประเมินความสามารถในการต้านภาวะเครียดออกซิเดชันของเซลล์จากการกระตุ้นด้วยการฉายรังสียูวีของแอสตาแซนทินเมื่อใช้ liposome เป็นพาหะนำส่ง พบว่าแอสตาแซนทินสามารถลดภาวะเครียดออกซิเดชันได้ดีที่สุดเมื่อให้รังสีและแอสตาแซนทินพร้อมกัน และการวัดค่ากิจกรรมของเอนไซม์ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ catalase ก็ให้ผลทำนองเดียวกันที่สภาวะที่มีแอสตาแซนทินร่วมด้วย ดังนั้นแอสตาแซนทินใน liposome จะมีความเสถียรกว่า และให้การปลดปล่อยแอสตาแซนทินได้ช้าๆ เมื่อเทียบกับแอสตาแซนทินบริสุทธิ์ ซึ่งทำให้สามารถนำข้อมูลการศึกษาข้างต้นไปประยุกต์ใช้พัฒนาผลิตภัณฑ์ในการบรรเทาภาวะเครียดออกซิเดชันจากการฉายรังสีได้

Astaxanthin, a red carotenoid pigment has been used as additive in animal feeds for colorization. The high antioxidant activity of astaxanthin over other carotenoids has attracted more and more interest for health additive products due to its health benefits to human and degenerative diseases prevention. However, natural astaxanthin production by Phaffia rhodozyma yeast is very low which makes it very expensive. In addition, fat-soluble pigment of astaxanthin causes some problem in its availability to biological functions. As a consequence, this research is aimed to improve astaxanthin production at low cost by improving carotenoid content in Phaffia rhodozyma via ethyl-methanesulfonate (EMS) mutagenesis and selection for the appropriate medium from agricultural products. Then, properties of astaxanthin from yeast extract including its suitable delivery system to the cells were explored.

Repetitive mutation of Phaffia rhodozyma yeast was performed using Ethyl methanesulphonate (EMS). Increasing EMS concentration could lower cell viability as well as mutated yeast. Mutation of GM807 and N78 strains resulted in orange-red colony, while FN99 produced orange, yellow and white colony. Only GM807 gave carotenoid-hyperproducing strains that produced 2.7 times higher carotenoid content than its parental strain. However, repeated yeast mutagenesis and colony selection using β-ionone resulted in quite stable hypercarotenoid producing mutants. The selected strains produced higher astaxanthin content as determined by HPLC.

Growth patterns and carotenoid productions were similar among the select strains of GBF8, GBF9 and S4 as compared to original strain of GM807 in YM medium. Highest cell mass was obtained on day 2, while highest carotenoid production was observed on day 6. The optimum pH for cell growth was at 6.5 whereas; the optimum pH for carotenoid production was relatively lower. Among the selected medium from agricultural products, pineapple juice enhanced growth of all yeast more than coconut juice, sugar cane juice and yeast malt (YM) medium, respectively. Though its carotenoid content was higher in YM medium than that of in pineapple, coconut and sugar cane juice, pineapple juice seemed to be the most applicable and economical supportive medium for yeast growth as well as carotenoid production. The appropriate C:N ratio in culture medium could also provide higher carotenoid production.

Characterization of the extracted astaxanthin from mutant yeast was performed in comparison with synthetic astaxanthin or β-carotene. The best solvents for these carotenoid were DMSO and THF at lower than 1% for Hela, HepG2 and Vero cells. Cytotoxicity of the extracted astaxanthin was not presented whereas it could enhance growth of Vero, HepG2 and Hela cells, consecutively. Additionally, it could diminish toxicity induced by t-BHP which was more effective in Vero than Hela cells. Protective effect of astaxanthin from oxidative damage induced by t-BHP was demonstrated in both astaxanthin pretreated and post-treated cells by suppression membrane lipid peroxidation. By cell-free DPPH assay, higher scavenging free radicals activity was found for synthetic astaxanthin than β-carotene and α-tocopherol. The Effective dose concentration 50% (EC50) of astaxanthin was higher than β-carotene and α-tocopherol for 2.85 and 4.43 times, respectively. The relatively low activity in the extracted astaxanthin was possibly due to contaminated solvent and the lower content of astaxanthin at 74% in the extract as compared to synthetic astaxanthin.

Limitation in bioavailability and antioxidant activity of astaxanthin due to its low solubility and instability was overcome by using delivery system of lipid based polymer and surfactant. The tween 80, Mβ-CD and glycerol could be used at concentration of less than 0.1% (v/v), 0.2% (w/v) and 2% (v/v), respectively. Liposome and b-cyclodextrin could lessen the degradation rate of astaxanthin at room temperature but showed no different at 4 °C in the dark. Cellular uptake rate of astaxanthin was highest for liposome as compared to those by b-cyclodextrin and tween 80. Assessment of antioxidant activity in HepG2 cells from UV inducing oxidative stress showed that astaxanthin could lessen MDA level as well as increase catalase activity. Additionally, astaxanthin with liposome could stabilize its antioxidant activity as compared with astaxanthin alone. Thus, these informative data could be useful as model for effective use of astaxanthin in reduction of oxidative stress induced by UV.

URLhttp://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=DBG5180019
Alternate TitleLow cost production of astaxanthin and improvement of its delivery for cell use